发酵法高效制备 N-乙酰神经氨酸的关键技术

成果编号：37152

价格：200

完成单位：江南大学

单位类别：211系统院所

完成时间：2022年

成熟程度：研制阶段

服务产业领域：生物技术与医药

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N-乙酰神经氨酸（NeuAc）是唾液酸类化合物中最主要的一种，也是母乳寡糖中重要的单糖组成单元，具有促进婴儿大脑发育和增强机体免疫力等功效。同时，NeuAc也是一种重要的药物中间体，以NeuAc为骨架结构进一步修饰得到的衍生物具有抗炎和抗癌的功效。传统NeuAc生产方法主要是从卵黄、牛初乳和燕窝中提取以及化学合成。由于NeuAc在天然原料中总含量低，提取分离过程复杂，导致传统提取法收率低、成本高。而化学法反应条件苛刻，工艺复杂，反应过程中产生的中间体及异构体影响产物的分离，导致生产成本居高不下。因此，开发一种绿色、可持续的方法生产食品安全级NeuAc成为一项亟待解决的课题。本项目以前期研究中构建的能够合成NeuAc的食品安全级菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为出发菌株，通过分析与鉴定NeuAc前体供给途径动力学的限速步骤、建立动态调控机制动态调控前体供给途径和平衡底物在细胞生长与NeuAc合成之间流量分配，实现NeuAc高效合成。

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成果介绍

科技计划：国家级：国家自然科学基金优秀青年科学基金

成果形式：新技术

合作方式：技术转让

参与活动：

专利情况：正在申请 ,其中:发明专利 5 项
已授权专利,其中:发明专利 5 项
专利号:
ZL201910382139.X
ZL202010238268.4
ZL202010237111.X
ZL202010237125.1
ZL202010238266.5

成果简介

综合介绍

创新要点

(1) 通过枯草芽孢杆菌密码子扩展系统的构建，建立了滴定非天然氨基酸对细胞生长与产物合成进行精准调控的策略。通过理性设计结合文库的构建与高通量筛选，获得了枯草芽孢杆菌高效非天然氨基酸利用工具pBUA-p224，实现了基因表达精确调控且不受胞内代谢产物影响。通过非天然氨基酸依赖性菌株的构建，实现细胞生长与产物合成的平衡调控，使NeuAc产量提升33%至4.7 g/L。此外，应用非天然氨基酸利用工具实现了重组菌株防逃逸。 (2) 结合合成途径重构、多来源NeuB共表达、PEP供给强化与细胞生长精确调控，构建了中间代谢物GlcNAc消除的高效合成NeuAc枯草芽孢杆菌底盘细胞。通过将常用的NeuB途径替换为NeuC途径，消除了NeuAc发酵过程中胞外GlcNAc的积累。通过对NeuC途径的强化、不同来源NeuB的共表达与PEP供给的强化，将NeuAc产量提升54.9%至7.9 g/L。通过密码子扩展系统对细胞必需蛋白MurB（细胞壁合成调节因子）进行了精细调控，以平衡细胞生长与生产，NeuAc在3 L发酵罐补料分批发酵中NeuAc最大产量为21.8 g/L，得率为0.04 g/g葡萄糖，生产强度为0.34 g/L/h。

技术指标

1、发酵法合成 NeuAc 产量达到20 g/L，高产菌构建方面申请 5 项发明专利，其中授权专利5项。 2、建立了 NeuAc 生产工艺，发酵产量是目前报道最高产量。

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